基于工程化Cbx1 Chromodomain变体的泛赖氨酸甲基化识别工具开发及其在神经退行性疾病甲基化蛋白质组学研究中的应用

科研项目申请书

项目基本信息

项目名称：基于工程化Cbx1 Chromodomain变体的泛赖氨酸甲基化识别工具开发及其在神经退行性疾病甲基化蛋白质组学研究中的应用研究领域：蛋白质翻译后修饰（PTM）/ 化学生物学 / 蛋白质工程 / 神经退行性疾病项目类型：基础研究与应用开发

一、项目背景

1.1 赖氨酸甲基化：一个被低估的蛋白质翻译后修饰

蛋白质赖氨酸甲基化（Lysine Methylation, Kme）是发生在赖氨酸残基ε-氨基上的翻译后修饰，包括单甲基化（Kme1）、二甲基化（Kme2）和三甲基化（Kme3）三种形式。长期以来，对赖氨酸甲基化的研究主要集中在组蛋白上，组蛋白H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3等修饰在表观遗传调控中的核心地位已得到充分阐明（Jenuwein & Allis, Science 2001）。然而，越来越多的证据表明，赖氨酸甲基化在非组蛋白中也广泛存在，参与调控蛋白质稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用、亚细胞定位及酶活性等关键生物学过程。

2013年，Garcia课题组利用高分辨率质谱首次在全球水平鉴定了数百个赖氨酸甲基化位点，揭示了非组蛋白Kme的广泛分布（Garcia et al., 2013）。此后，多个研究组通过不同策略持续扩展了赖氨酸甲基化组的版图（Gozani et al., 2013; Cornett et al., 2023; Berryhill et al., 2025）。特别是在神经退行性疾病领域，Ehrnhoefer等（2021）发现SETD7介导的Tau蛋白单甲基化在阿尔茨海默病中显著富集于可溶性Tau组分，提示Kme修饰可能参与Tau蛋白的聚集调控和疾病进展。Sun等（2025）开发的SRMs-ITP策略进一步实现了甲基化肽段的高效富集，为甲基化蛋白质组学提供了新的技术路径。

1.2 赖氨酸甲基化研究的关键瓶颈：缺乏高质量的泛识别工具

与磷酸化蛋白质组学已拥有成熟的高质量泛抗体（pan-specific antibodies）不同，赖氨酸甲基化的富集和检测工具长期处于匮乏状态。现有的pan-Kme抗体存在以下突出问题（Hof et al., Anal. Chem. 2016; Cornett et al., 2023）：

（1）批次间差异大：商业化pan-Kme抗体多为多克隆抗体，不同批次间的特异性和亲和力难以保持一致；（2）偏好的序列背景限制：抗体对不同序列背景（flanking sequences）的Kme位点识别能力存在显著偏好，导致甲基化组的覆盖存在严重偏差（bias）；（3）稳定性不足：抗体的多克隆性质和长期储存的不稳定性限制了其在标准化分析流程中的应用。

因此，开发一种具有广谱Kme识别能力、高稳定性、可大规模生产的亲和工具，是推动赖氨酸甲基化研究领域发展的迫切需求。

1.3 Chromodomain工程化改造的突破：从天然特异性到人工泛结合性

Chromodomain（染色质组织修饰域）是一类进化上高度保守的蛋白质结构域，天然存在于HP1（Heterochromatin Protein 1）、Polycomb等染色质相关蛋白中。Cbx1（Chromobox 1，即HP1β）的chromodomain通过由三个芳香族残基构成的"芳香笼"（aromatic cage）特异性识别组蛋白H3K9me2/me3。这一识别机制以阳离子-π相互作用为核心，对甲基化赖氨酸具有本质上的化学亲和力。

2018年，Hard等系统解析了chromodomain识别甲基化赖氨酸肽段的分子基础，揭示了决定序列选择性的关键残基，为工程化改造提供了结构指导（Hard et al., 2018）。2020年，Parkinson等进一步展示了通过定向进化（directed evolution）结合神经网络辅助的序列-功能建模，可以成功改造组蛋白reader蛋白的识别特性，获得具有所需结合谱的变体蛋白（Parkinson et al., 2020）。

Gozani实验室的前驱性工作也证明了天然甲基化结合域可以被改造为泛识别工具。他们基于L3MBTL1的MBT结构域重复序列，通过蛋白质工程获得了能够广泛识别单甲基化和二甲基化赖氨酸的泛亲和试剂，并成功应用于全球赖氨酸甲基化组的鉴定（Gozani et al., 2013）。这一策略的成功为利用其他甲基化reader结构域的工程化改造提供了重要的概念验证。

1.4 本课题组的前期研究基础

我们基于Cbx1（HP1β）的chromodomain结构域，通过理性设计和定向进化的组合策略，成功开发了一系列对赖氨酸甲基化修饰具有泛结合能力的变体蛋白（Cbx1-CD variants）。前期已完成的核心实验数据包括：

（1）甲基化修饰肽丙氨酸扫描结合测试（Alanine Scanning）：系统测定了变体蛋白对Kme位点周围各位置残基的依赖性，证实了改造后的变体蛋白对Kme位点周围序列背景的依赖性显著低于野生型，即具有更广谱的序列容忍度；

（2）表面等离子体共振（SPR）亲和力测试：定量测定了变体蛋白与多种不同序列背景的Kme1/me2/me3肽段的结合动力学参数（Kd、ka、kd），结果显示变体蛋白对me1、me2和me3均具有微摩尔至亚微摩尔级别的亲和力，证实了其泛甲基化状态结合能力；

（3）竞争结合实验：通过非甲基化肽段的竞争实验，验证了变体蛋白的结合严格依赖于赖氨酸残基上的甲基化修饰，具有优良的修饰状态选择性。

上述实验结果为Cbx1-CD变体蛋白作为泛Kme识别工具的应用奠定了坚实基础。然而，目前尚缺乏以下关键环节：

（1）变体蛋白在复杂生物样品中的实际富集性能验证；（2）基于该变体蛋白的甲基化蛋白质组学工作流程（workflow）的建立和优化；（3）在疾病相关模型中的实际应用验证——特别是神经退行性疾病模型。

1.5 项目提出的科学问题

基于上述研究背景和前期基础，本项目拟回答以下核心科学问题：

（1）Cbx1-CD变体蛋白能否在复杂蛋白质组背景下实现对Kme修饰肽段的高效、广谱富集？（2）基于该变体蛋白的亲和富集-质谱分析（AP-MS）流程在甲基化组覆盖深度和广度上能否超越现有的pan-Kme抗体方法？（3）将该工具应用于神经退行性疾病模型（阿尔茨海默病、帕金森病），能否揭示新的Kme修饰调控机制和疾病生物标志物？

二、项目目的

2.1 总体目标

本项目旨在将已开发的Cbx1-CD泛Kme结合变体蛋白从体外结合验证推进至完整的技术平台和应用验证阶段，建立一套基于工程化chromodomain变体蛋白的赖氨酸甲基化组学分析体系，并初步探索其在神经退行性疾病研究中的应用价值。

2.2 具体目标

目标一：建立并优化基于Cbx1-CD变体蛋白的甲基化肽段富集-质谱鉴定流程（AP-MS workflow）

（1）确定变体蛋白固相偶联的最优条件（偶联化学方法、偶联密度、固相载体类型）；（2）优化富集条件（结合/洗涤/洗脱缓冲液、孵育时间、温度等），以最大化Kme肽段的回收率和特异性；（3）利用标准Kme肽段混合物和已知甲基化状态的蛋白质酶解物，系统评估富集效率、特异性、重现性和定量线性范围。

目标二：在全局蛋白质组水平验证Cbx1-CD变体蛋白的甲基化组覆盖能力

（1）以HeLa或HEK293T细胞全蛋白质酶解物为模型样品，平行比较Cbx1-CD变体蛋白与商业化pan-Kme抗体（如PTMScan pan-Kme）的富集效果；（2）通过LC-MS/MS鉴定富集的甲基化肽段，从鉴定数量、甲基化状态分布（me1/me2/me3）、序列motif多样性、亚细胞分布等维度系统比较两种方法；（3）利用稳定同位素标记（如SILAC或TMT）进行定量比较，评估两种方法的定量准确性和重复性。

目标三：构建Cbx1-CD变体蛋白富集-甲基化组学分析的技术标准

（1）制定标准操作流程（SOP），包括样品制备、富集、质谱数据采集和生物信息学分析的全流程；（2）评估方法的批次间重复性和不同操作人员间的再现性；（3）编写详细的方法学论文，为该领域提供可参考的技术标准。

目标四：在神经退行性疾病模型中应用该技术平台，发现新的Kme调控机制

（1）利用已建立的AP-MS workflow分析阿尔茨海默病（AD）模型（如Tau转基因小鼠脑组织或AD患者脑脊液）中的甲基化蛋白质组变化；（2）利用已建立的AP-MS workflow分析帕金森病（PD）模型（如α-synuclein转基因模型或PD患者样本）中的甲基化蛋白质组变化；（3）整合甲基化组学数据与已有的磷酸化组学和乙酰化组学数据，构建AD/PD的多维PTM调控网络；（4）验证关键Kme位点的功能意义（甲基化对靶蛋白稳定性、相互作用、定位或活性的影响），评估其作为疾病生物标志物或治疗靶点的潜力。

三、项目意义

3.1 技术方法学意义

本项目将首次实现基于工程化chromodomain的泛Kme亲和工具在复杂蛋白质组学中的应用验证。与现有的pan-Kme抗体相比，基于重组蛋白的亲和工具具有以下优势：

（1）可大规模重组表达和纯化，批次间一致性高，无动物免疫的伦理问题；（2）可通过基因工程手段进一步优化结合特性（亲和力、特异性、结合谱），具有持续改进的潜力；（3）热稳定性和化学稳定性优于抗体，更适合在多样化的实验条件下使用；（4）生产成本低，易于标准化推广。

如果成功验证，该工具将填补赖氨酸甲基化研究领域的关键技术空白，成为与磷酸化蛋白质组学中泛磷酸化抗体同样重要的基础研究工具。从2013年Gozani实验室利用工程化MBT结构域开创了这一方向以来，利用chromodomain进行工程化改造代表了该领域的新进展，具有重要的方法学创新价值。

3.2 基础生物学意义

非组蛋白赖氨酸甲基化的功能研究仍处于起步阶段。当前，对Kme修饰的功能理解主要受限于两个因素：（1）缺乏高质量的全局鉴定工具；（2）缺乏系统性的功能验证。本项目建立的甲基化组学分析体系将显著提升Kme修饰位点的鉴定通量和覆盖深度，为系统性研究Kme修饰的生物学功能提供数据基础。

在神经退行性疾病方面，已有研究表明Kme修饰参与Tau蛋白的聚集调控（Ehrnhoefer et al., 2021）、α-synuclein的功能调节等关键过程。然而，目前对AD和PD中全局甲基化组的变化模式仍知之甚少。本项目将为揭示Kme修饰在神经退行性疾病中的整体调控规律提供关键技术手段。

3.3 转化医学意义

赖氨酸甲基化修饰的异常与多种疾病密切相关，包括癌症（Berryhill et al., 2025; G9a在乳腺癌中的作用）、神经退行性疾病和代谢性疾病。赖氨酸甲基转移酶（KMTs）和去甲基化酶（KDMs）已成为重要的药物开发靶点。

本项目建立的技术平台将有助于：

（1）发现新的疾病相关Kme修饰位点，扩展药物靶点的选择范围；（2）系统监测疾病进展和治疗响应中的甲基化组动态变化，为精准医疗提供新的生物标志物；（3）通过解析Kme修饰的底物谱和调控网络，为KMT/KDMs抑制剂的药效学和药理学评价提供技术支持。

3.4 蛋白质工程学意义

本项目的成功将提供一个蛋白质工程学应用于解决实际生物学问题的典型案例。从天然chromodomain的特异性识别到人工泛识别能力的转化，展示了理性设计与定向进化相结合在reader蛋白改造中的强大潜力。这一方法论框架可推广至其他PTM识别结构域的工程化改造（如bromodomain对乙酰化、SH2对磷酸化等），具有广泛的示范效应。

四、项目整体规划

4.1 总体技术路线

本项目采取"工具优化→性能验证→疾病应用"的三阶段递进策略，各阶段相互衔接，共同构成完整的研发链条。

4.2 阶段一：Cbx1-CD变体蛋白富集体系建立与优化（第1-8个月）

任务1.1：变体蛋白的规模化制备与质量控制（第1-2个月）

• 优化Cbx1-CD变体蛋白的大肠杆菌表达条件（诱导温度、IPTG浓度、表达时长）
• 建立亲和层析（His-tag/GST-tag）→ 离子交换 → 凝胶过滤的多步纯化方案
• 制定纯度（>95%）和活性（SPR验证Kme结合能力）的质量控制标准
• 建立冻干保存方案，验证复溶后的活性保持

任务1.2：固相偶联方法的比较与优化（第2-4个月）

• 比较三种偶联策略：NHS酯活化的琼脂糖珠（随机氨基偶联）、Click化学（定点偶联）、生物素-链霉亲和素系统
• 参考Li课题组（2018）的亲和引导共价偶联（AGCC）策略，探索定点定向偶联方案
• 以偶联效率、结合活性和非特异性吸附为评价指标，确定最优偶联方案
• 优化偶联密度，平衡结合容量和空间位阻

任务1.3：富集条件优化（第3-5个月）

• 以标准Kme肽段混合物为模型，通过正交实验设计优化以下参数：· 结合缓冲液：pH（6.5-8.5）、盐浓度（50-300mM NaCl）、去垢剂种类和浓度· 洗涤条件：洗涤次数、洗涤液盐浓度梯度· 洗脱条件：酸性洗脱（0.1% TFA）vs 竞争性洗脱（游离Kme）
• 以回收率和特异性（非甲基化肽段携带率）为评价指标
• 建立优化后的标准操作流程（SOP v1.0）

任务1.4：方法学性能评估（第5-8个月）

• 灵敏度评估：以已知甲基化状态的标准蛋白（如甲基化的组蛋白H3、重组Tau蛋白等）为测试样品，确定最低检测限（LOD）
• 动态范围评估：制备不同比例的甲基化/非甲基化蛋白混合物，评估定量线性范围
• 重复性评估：对同一样品进行至少3次独立富集-质谱分析，计算鉴定位点的重叠率和CV值
• 选择性验证：确认富集产物中Kme位点的富集倍数（fold enrichment）显著高于非Kme肽段

4.3 阶段二：全局甲基化蛋白质组学验证与比较（第6-14个月）

任务2.1：与商业化pan-Kme抗体的系统比较（第6-10个月）

• 使用HeLa细胞全蛋白裂解液（500μg/组），平行进行Cbx1-CD变体蛋白和商业化pan-Kme抗体的富集
• 每组至少3次生物学重复
• LC-MS/MS分析（Orbitrap或timsTOF平台，DDA或DIA模式）
• 比较指标：· 鉴定Kme位点总数· me1/me2/me3分布比例· 序列motif分析（iceLogo或pLogo）——评估两种方法对序列背景偏好的差异· 鉴定位点的亚细胞分布（GO分析）· 两种方法鉴定位点的重叠率及独有位点的特征分析
• 统计假设：Cbx1-CD变体蛋白富集的Kme位点在序列motif多样性上显著优于pan-Kme抗体

任务2.2：定量甲基化组学方法的建立（第8-12个月）

• 建立基于TMT（Tandem Mass Tag）标记的定量甲基化组学流程
• 评估定量准确性和重复性：制备已知比例混合的轻/重标样品，验证定量比值与理论值的一致性
• 建立生物信息学分析pipeline：· 原始质谱数据搜库（MaxQuant或Proteome Discoverer）· Kme位点定位概率评分（localization probability）· 差异甲基化位点的统计筛选· 功能富集分析（GO、KEGG、PPI网络）

任务2.3：方法学论文撰写与发表（第10-14个月）

• 系统整理阶段一和阶段二的实验数据
• 撰写方法学论文，目标期刊：Analytical Chemistry / Journal of Proteome Research / Molecular & Cellular Proteomics
• 发布标准操作流程（SOP）和关键试剂信息，促进方法的推广和应用

4.4 阶段三：神经退行性疾病模型中的应用研究（第12-24个月）

任务3.1：阿尔茨海默病模型中的甲基化蛋白质组学研究（第12-18个月）

• 样品来源：Tau P301S转基因小鼠脑组织（海马体和皮层），以同窝野生型为对照
• 每组至少4只小鼠（生物学重复）
• 实验流程：· 脑组织蛋白提取和酶解（胰蛋白酶 + LysargiNase组合以增加序列覆盖度）· Cbx1-CD变体蛋白富集Kme肽段· TMT标记定量· LC-MS/MS分析
• 数据分析重点：· 鉴定AD模型中差异Kme修饰位点· 聚焦Tau蛋白上的Kme位点变化，与已有文献数据（Ehrnhoefer et al., 2021）进行比较验证· 分析差异Kme蛋白的功能网络，重点关注突触功能、线粒体功能、蛋白质稳态通路· 整合公共数据库中AD磷酸化组学和乙酰化组学数据，构建PTM crosstalk网络

任务3.2：帕金森病模型中的甲基化蛋白质组学研究（第14-20个月）

• 样品来源：α-synuclein A53T转基因小鼠脑组织（中脑和纹状体），以同窝野生型为对照
• 实验流程同任务3.1
• 数据分析重点：· 鉴定PD模型中差异Kme修饰位点· 聚焦α-synuclein及其相互作用蛋白的Kme修饰变化· 分析与多巴胺能神经元退变相关的Kme修饰变化· 与AD数据集进行交叉比较，识别神经退行性病变的共同Kme调控通路和疾病特异性修饰模式

任务3.3：关键Kme位点的功能验证（第16-22个月）

• 从任务3.1和3.2中筛选Top 10-20个显著差异的Kme位点进行功能验证
• 验证策略包括：· 定点突变（K→R/K→A模拟非甲基化；K→F模拟甲基化）结合功能实验· 体外甲基化/去甲基化酶反应验证KMT/KDMs对靶位点的催化活性· 甲基化对蛋白质稳定性（CHX chase assay）、亚细胞定位（免疫荧光）、蛋白相互作用（Co-IP）的影响· 对于Tau蛋白的Kme位点，评估甲基化对其聚集倾向（ThT assay）和微管结合能力的影响· 对于α-synuclein的Kme位点，评估甲基化对其寡聚化和纤维化形成的影响

任务3.4：生物标志物和治疗靶点潜力评估（第18-24个月）

• 验证疾病特异性Kme位点在脑脊液（CSF）或血液外泌体中的可检测性
• 评估候选Kme生物标志物的诊断敏感性和特异性（ROC分析）
• 对于具有明确功能意义的Kme位点，探索其作为治疗靶点的潜力· 利用KMT/KDMs小分子抑制剂验证靶点可药性（druggability）· 评估靶向干预Kme修饰对疾病相关表型的改善效果

4.5 阶段四：技术转化与应用拓展（第20-24个月）

任务4.1：Cbx1-CD变体蛋白的工程化优化（持续）

• 基于阶段二和三的数据反馈（例如发现的序列偏好），进行新一轮的理性设计或定向进化
• 探索将变体蛋白改造为活细胞内的Kme探针（如融合荧光蛋白用于活细胞成像）
• 开发基于Cbx1-CD变体蛋白的ELISA或LFA快速检测试剂盒

任务4.2：知识产权保护与技术推广

• 申请Cbx1-CD变体蛋白及其应用的发明专利
• 与非营利性试剂资源库（如Addgene）合作，分发表达质粒
• 与生物技术公司合作，探索商业化试剂盒的开发

4.6 时间节点汇总

4.7 预期成果

（1）建立一套完整、标准化的基于Cbx1-CD变体蛋白的赖氨酸甲基化组学分析体系，包括富集SOP、质谱分析方法和生物信息学分析pipeline；（2）获得Cbx1-CD变体蛋白与商业化pan-Kme抗体在全局甲基化组覆盖能力上的系统比较数据，明确其优势和应用边界；（3）获得阿尔茨海默病和帕金森病模型的全局Kme修饰图谱，发现不少于50个疾病相关的差异Kme修饰位点；（4）完成不少于10个关键Kme位点的功能验证，阐明其参与疾病发生发展的分子机制；（5）发表SCI论文2-3篇（其中方法学论文1篇，疾病应用研究论文1-2篇），申请发明专利1-2项。

4.8 风险评估与应对措施

五、参考文献

[1] Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code. Science, 2001, 293(5532): 1074-1080.

[2] Moore KE, et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular Cell, 2013, 50(3): 444-456.

[3] Carlson SM, et al. Large-scale global identification of protein lysine methylation in vivo. Nature Protocols, 2013. (Garcia Lab)

[4] Berryhill CA, et al. Global lysine methylome profiling using systematically characterized affinity reagents. Scientific Reports, 2023.

[5] Berryhill CA, et al. Quantitative analysis of nonhistone lysine methylation sites and lysine demethylases in breast cancer cell lines. Journal of Proteome Research, 2025.

[6] Bichmann M, et al. SETD7-mediated monomethylation is enriched on soluble Tau in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration, 2021.

[7] Sun M, et al. Global methylation profiling by selective release of methylated sites from immobilized tryptic peptides. Analytical Chemistry, 2025.

[8] Hof F, et al. An anionic supramolecular host for the enrichment and detection of methylated lysine. Analytical Chemistry, 2016, 88(7): 3776-3783.

[9] Hard R, et al. Deciphering and engineering chromodomain-methyllysine peptide recognition. Science Advances, 2018, 4(9): eaau8670.

[10] Parkinson J, et al. Engineering a histone reader protein by combining directed evolution, sequencing, and neural network based ordinal regression. Nature Communications, 2020.

[11] Wang Z, et al. Affinity purification of methyllysine proteome by site-specific covalent conjugation. Analytical Chemistry, 2018, 90(23): 13876-13881.

[12] Cumming MG, et al. Mass spectrometry for lysine methylation: principles, progress, and perspectives. Mass Spectrometry Reviews, 2025.

[13] Magnani R, et al. Calmodulin methyltransferase is an evolutionarily conserved enzyme. 2010.

[14] Casadio F, et al. G9a drives hypoxia-mediated gene repression for breast cancer cell survival and tumorigenesis. (G9a/GLP pathway)

[15] Wu M, et al. A chemoselective enrichment strategy for in-depth coverage of the methylproteome. 2024/2026. (Westlake University)